中学生彼特·帕克自幼父母双亡，他与心爱的梅婶母和本叔叔一起生活在纽约皇后区。彼特过着一个普通的学生生活，在校报担任一名摄影师，暗恋着美丽的玛丽·简·沃森，并经常与死党哈里.奥斯本一起到处游荡。　　在一次学校组织的旅游中，彼特和他的同学们参观了一个有关节肢动物的科学展览，期间，彼特被一个转基因蜘蛛咬了一口。不久之后，他发现自已具有了非同寻常的能力：他成了一只力量超凡、身手敏捷的蜘蛛，并且还具有了一种敏锐的超感知“蜘蛛感官”。　　彼特首先利用他的能力去挣钱，但是血本无归以后，他牢记心爱的本叔叔的话：“用超人的力量担负起伟大的责任”，他发誓要将自己的一生献给与犯罪行为作斗争。　　与此同时，哈里的父亲、军火商人诺尔马·奥斯本(Norman Osborn，威廉·达福饰)，也正在经历他自己的一些变数。一次实验方案出了差错，诺尔马的智慧和力量大增，但也让他陷入了精神错乱。诺尔马现在成为了蜘蛛侠的主要对手——绿恶魔，他将彻底考验年轻的彼特·帕克与犯罪行为作战、帮助无辜人们的誓言。

大战绿妖之后，蜘蛛侠帕克（托比•马奎尔 Tobey Maguire 饰）忍痛拒绝了他唯一的挚爱玛丽（克尔斯滕•邓斯特 Kirsten Dunst 饰），因为蜘蛛侠的身份会为自己和亲人带来巨大危险，帕克决定独立承担起蜘蛛侠的责任。帕克一直在忙于应付各种挑战：学习超能力的灵活运用；在超级英雄与平凡大学生的双重身份下隐藏自我、小心翼翼地生活等等。帕克对玛丽越来越难以自拔，但是作为蜘蛛侠又不能对玛丽展开心扉。好友哈利因为误会蜘蛛侠而一直处处与其为作对；唯一的亲人婶婶也对蜘蛛侠的真实身份产生了怀疑。同时，新的挑战又出现了：邪恶而强大的章鱼博士。帕克在种种压力下肩负起蜘蛛侠的使命。

蜘蛛侠在经历了重重考验之后，成为了人人敬仰的正义英雄，抱得美人归。但是，光环下蜘蛛侠，也有自己的心病：他在第一集时放走了小偷导致最亲爱的叔叔被小偷杀死，帕克一直耿耿于怀。　　生活顺意的帕克开始变得目中无人，当他再次抓到那个小偷时，残忍地看着他从楼上摔下致死，过后才发现自己惩罚错了人，真凶是“沙人”。当帕克将“沙人”残忍杀死后，帕克心内的阴暗面渐渐在帕克的身体内占据了上风，蜘蛛侠最终演变成邪恶的“毒蜘蛛”！糟糕的是，帕克没有察觉到自身的变化，帕克最终如何摆脱自身的邪恶？

在复仇者联盟众英雄的努力下，于灭霸无限手套事件中化作为灰烬的人们，重新回到了人世间，曾经消失的蜘蛛侠 彼得帕克 也回归到了普通的生活之中，数月后，蜘蛛侠彼得帕克所在的学校举行了欧洲旅游，帕克也在其中， 在欧州威尼斯旅行时，一个巨大无比的水怪袭击了威尼斯，不敌敌人的蜘蛛侠幸得一位自称神秘客的男子搭救才击退敌人，之后 神盾局局长找上正在旅游的彼得帕克并要求其加入神盾局，并安排神秘客协助帕克，神秘客自称来自其他宇宙，并告知一群名为元素众的邪恶势力已经入侵这个宇宙了，为了守护来之不易的和平，蜘蛛侠决定与神秘客联手，然而在神秘客那头罩之中，似乎隐藏着什么不为人知的真相……

该片讲述了普通高中生迈尔斯·莫拉斯如何师从蜘蛛侠彼得·帕克，成长为新一代超级英雄的故事。影片中迈尔斯和从其它平行宇宙中穿越而来的彼得、女蜘蛛侠格温、暗影蜘蛛侠、潘妮·帕克和蜘猪侠集结成团，六位蜘蛛侠首次同框大银幕，对抗蜘蛛侠宇宙最强反派。